Sekvenciranje DNK: od Sangerove metode do savremenih pristupa

Sekvenciranje DNK predstavlja proces određivanja tačnog redosleda nukleotida u molekulu DNK i jedno je od najvažnijih dostignuća savremene biologije. Razvoj ovih tehnologija omogućio je da danas možemo da „čitamo” genome organizama, razumemo nasledne bolesti i pratimo evolucione procese sa do sada neviđenom preciznošću. Tokom poslednjih nekoliko decenija sekvenciranje je prošlo kroz nekoliko ključnih faza, koje se često opisuju kao generacije tehnologija – od klasične Sangerove metode, preko masovnog short-read, do long-read sekvenciranja i najnovijih in situ pristupa koji omogućavaju analizu direktno u tkivu.

Sangerovo sekvenciranje

Prva široko primenjena metoda bila je Sangerovo sekvenciranje, razvijena sedamdesetih godina prošlog veka. Ona se zasniva na kontrolisanom prekidanju sinteze DNK pomoću dideoksinukleotida, što dovodi do stvaranja fragmenata različitih dužina koji se zatim razdvajaju i detektuju kapilarnom elektroforezom. U praksi se gotovo uvek koristi PCR amplifikacija ciljanog regiona kako bi se obezbedila dovoljna količina materijala za analizu. Ova metoda omogućava veoma visoku tačnost, ali je ograničena dužinom očitavanja od oko 500 do 1.000 baznih parova, kao i relativno niskim kapacitetom. Zbog toga je danas uglavnom zamenjena drugim tehnologijama, ali se i dalje koristi za verifikaciju rezultata i analizu kraćih regiona DNK.

Šema Sangerovog sekvenciranja

Izvor: https://theory.labster.com/dna_sequencing/

NGS: Short-read sekvenciranje

Razvoj druge generacije sekvenciranja, poznate kao sekvenciranje naredne generacije (engl. next-generation sequencing, NGS), potpuno je promenio genetiku. Platforme kao što su Illumina omogućile su paralelno čitanje miliona fragmenata DNK, čime je dramatično povećan obim podataka i smanjena cena po pročitanom nukleotidu. DNK se najpre fragmentiše, zatim se na krajevima fragmenata vezuju adapteri, a potom se u većini protokola koristi PCR amplifikacija, mada postoje i varijante koje ne korste PCR. Dužina očitavanja (engl. read) u ovoj tehnologiji najčešće se kreće između 50 i 300 baza, dok u parnom čitanju, koje omogućava čitanje istog fragmenta sa oba kraja, može dostići i oko 600 baza, odakle naziv short-read sekvenciranje, odnosno sekvenciranje kratkih očitavanja. Ove metode odlikuje visoka tačnost i ogromna propusnost, ali otežano sklapanje sekvence u ponovljenim i strukturno kompleksnim regionima ostaje značajno ograničenje.

Illumina sekvenciranje 

Izvor: https://en.wikipedia.org/wiki/Illumina_dye_sequencing

Long-read sekvenciranje

Treća generacija sekvenciranja razvijena je kako bi se prevazišla ograničenja druge generacije i omogućilo čitanje mnogo dužih segmenata DNK. Tehnologije poput PacBio SMRT (engl. Single Molecule, Real-Time) i Oxford Nanopore Technologies omogućavaju analizu pojedinačnih molekula DNK bez potrebe za PCR amplifikacijom u osnovnoj detekciji. Kod sekvenciranja kroz nanopore, molekul DNK prolazi kroz proteinsku nanoporu smeštenu u membrani kroz koju protiče električna struja. Kako različite baze prolaze kroz poru, dolazi do specifičnih promena u jačini električnog signala. Softver zatim te promene prevodi u odgovarajući niz nukleotida. Na ovaj način moguće je direktno sekvencirati veoma duge molekule DNK u realnom vremenu, a tehnologija omogućava i detekciju određenih epigenetičkih modifikacija bez dodatne pripreme uzorka. Sa druge strane, PacBio SMRT tehnologija zasniva se na praćenju aktivnosti DNK polimeraze tokom sinteze novog lanca DNK u realnom vremenu. Fluorescentno obeleženi nukleotidi emituju signale koji omogućavaju određivanje redosleda baza. Ova metoda omogućava dobijanje veoma dugih i visoko tačnih očitavanja, zbog čega je značajna za de novo sklapanje genoma i analizu strukturnih varijanti. 

Dužine očitavanja mogu biti od nekoliko hiljada baza pa sve do preko milion u određenim slučajevima. Ove metode su posebno važne za otkrivanje strukturnih varijanti, kompleksnih genomskih regiona i de novo sklapanje genoma. Njihova slabost je veća stopa greške po pojedinačnoj bazi, iako se ona u praksi kompenzuje dubinom pokrivenosti i naprednim algoritmima obrade podataka. Dubina pokrivenosti predstavlja prosečan broj puta kada je određena baza u genomu očitana tokom sekvenciranja. Veća dubina pokrivenosti omogućava da se slučajne greške u pojedinačnim očitavanjima identifikuju i isprave poređenjem većeg broja sekvenci koje pokrivaju isti region genoma, čime se značajno povećava tačnost konačne sekvence. 

Šema sekvenciranja kroz nanopore

Izvor: https://www.nature.com/articles/s41587-021-01108-x

Sekvenciranje in situ

Najnoviji pravac razvoja ide ka in situ pristupima, koji predstavljaju četvrtu generaciju i još uvek su u fazi intenzivnog razvoja. Ideja ovih metoda je da se sekvenciranje ili detekcija nukleinskih kiselina odvija direktno u ćeliji ili tkivu, bez potrebe za njihovim izolovanjem. Na taj način zadržava se prostorna informacija, što omogućava proučavanje ćelijskih interakcija i organizacije tkiva na molekularnom nivou. Ove metode često koriste lokalne amplifikacije i specifične bar-kodove, a PCR se primenjuje samo u ograničenom obimu ili u modifikovanim oblicima. Iako su još uvek skupe i tehnički zahtevne, one predstavljaju budućnost funkcionalne genomike.

Razvoj tehnologija sekvenciranja tokom poslednjih decenija doveo je do prelaska sa sporih i ograničenih metoda na savremene sisteme sposobne za brzo i detaljno analiziranje ogromnih količina genetičkih podataka. Od Sangerovog sekvenciranja do long-read i in situ pristupa, svaka nova generacija proširila je mogućnosti proučavanja genoma i omogućila preciznije razumevanje bioloških procesa. Kombinacija različitih tehnologija danas pruža sveobuhvatan uvid u strukturu i funkciju genetičkog materijala, zbog čega sekvenciranje ima centralnu ulogu u savremenoj biomedicini, dijagnostici i fundamentalnim istraživanjima.

Izvori:

• Pareek, C. S., Smoczynski, R., & Tretyn, A. (2011). Sequencing technologies and genome sequencing. Journal of Applied Genetics, 52(4), 413–435. https://doi.org/10.1007/s13353-011-0057-x 
• Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., & Akeson, M. (2016). The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology, 17, 239. https://doi.org/10.1186/s13059-016-1103-0 
• Amarasinghe, S. L., Su, Z., Dong, X., Zappia, L., Ritchie, M. E., & Gouil, Q. (2020). Opportunities and challenges in long-read sequencing data analysis. Genome Biology, 21(1), 30. https://doi.org/10.1186/s13059-020-1935-5 
• Ståhl, P. L., Salmén, F., Vickovic, S., Lundmark, A., Navarro, J. F., Magnusson, J., … Frisén, J. (2016). Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science, 353(6294), 78–82. https://doi.org/10.1126/science.aaf2403